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酵素が作用する物質のこと。また、受容体に結合する物質（リガンド）を指す場合もある。酵素は基質と認識した物質にしか作用しない（基質特異性）。例えば、消化酵素であるアミラーゼの基質はデンプンである。基質は酵素の表面にある特定の部位（活性中心や活性部位と呼ばれる）に結合し、酵素-基質複合体を作る。マトリックスを参照。

1958年に発見された、ビフィズス菌のビフィドシャントで中心的な役割を担う、チアミン二リン酸を補酵素とする酵素群。ホスホケトラーゼは基質にリン酸を付加してアセチルリン酸を生成する反応を触媒しますが、このアセチルリン酸こそが、ATPおよび酢酸が生産されるもととなります。基質となる有機化合物によって以下の種類に分けられる。-フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ（フルクトース-6-リン酸）-キシルロース-5-リン酸ホスホケトラーゼ（キシルロース-5-リン酸）

6位の炭素がリン酸化したフルクトースの誘導体。筋肉ではフルクトースはフルクトース-6-リン酸となり、解糖系で利用される。解糖系において、グルコースリン酸イソメラーゼに触媒されグルコース-6-リン酸からも生成される。また、マンノースも異性化酵素によってこの形となる。フルクトース-6-リン酸は、ホスホフルクトキナーゼによってフルクトース-1,6-ビスリン酸に代謝される。ビフィドシャントにおいてはアセチルリン酸の前駆体となる。

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